为建立同时检测绵羊肺腺瘤病毒（JSRV）和梅迪-维斯纳病毒（MVV）的实时荧光RPA检测方法，本试验基于JSRV env基因和MVV LTR序列的保守区，设计、筛选特异性引物和探针，优化反应体系和反应条件；对该检测方法进行特异性、灵敏性、重复性评估；利用建立的方法对实验室保存的已确诊为JSRV和MVV混合感染的病肺组织进行检测，并与双重PCR方法平行对比，计算吻合率。结果显示，该方法可在42℃、20 min内完成目标片段的扩增，对于混合感染病肺组织cDNA,JSRV和MVV的最低检测限分别为1ng/μL和10 pg/μL，该方法检测小反刍兽疫病毒（PPRV）、羊败血性链球菌（OSS）、牛肠道病毒（BEV）、传染性鼻气管炎病毒（IBRV）、牛副流感病毒3型（BPIV3）、肺炎支原体（MO）等继发反刍动物呼吸道症状的病原时呈阴性；分别以浓度为10 ng/μL和100 ng/μL的模板进行重复性试验，组内变异系数为3.6%～9.3%；实验室保存的JSRV和MVV混合感染病肺组织的检测结果与双重PCR方法的吻合率为100%。本研究成功建立了JSRV和MVV双重实时荧光RPA检测方法，该方法操作简单、反应快速，结果确实可靠，可用于JSRV和MVV的鉴别诊断及混合感染的快速临床检测。