采用RT-PCR方法扩增覆盖脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus,EMCV） XX1-19全基因组的3段cDNA片段，Eco RⅠ酶切真核表达载体pcDNA3.1使其线性化后，将3段cDNA片段同时连入载体，构建了含EMCV XX1-19全基因组的重组质粒。通过Bam HⅠ和NotⅠ酶切鉴定，结合菌液PCR扩增及测序验证，确认重组质粒构建成功，命名为pcDNA/XX1-19。将重组质粒经脂质体转染BHK21细胞进行病毒拯救，通过细胞病变效应观察、核酸完整性检测、电镜观察、TCID50检测等对拯救病毒进行鉴定，结果表明，构建的EMCV全长cDNA克隆具有感染性，可以拯救出病毒。一步生长曲线结果表明，拯救病毒与野生病毒具有相似的体外增殖特性。本研究建立的方法省去了基因片段的逐步克隆、拼接以及改造载体等繁琐步骤，避开了体外转录病毒RNA的弊端，利用pcDNA3.1载体的CMV启动子、通过同源重组及体内转录病毒RNA的方式，快速、高效地构建了感染性克隆并成功拯救出病毒。