L-天冬酰胺酶(L-asparaginase, ASNase)是一种氨基水解酶,被广泛应用在医药和食品领域。其中,来源于Escherichia coli K12的EcASNase已被用作治疗急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)的临床药物。但EcASNase较低的催化活性和稳定性限制了其在医药和食品等领域的应用。本研究通过易错PCR构建随机突变文库,结合偶联菌体生长的高通量筛选策略,筛选获得了三个活性提高的阳性突变体G38S、Q212Y、S274P,其活性分别是野生型(WT)的1.4、1.1和1.2倍。随后对38、212、274位点构建了饱和突变文库并进行了筛选,获得了活性提高的突变体G38A、G38S、G38Q、G38V,其k_(cat)/K_m值分别是WT的1.7、1.5、2.1和2.2倍,活性最优突变体G38V的T_m值较WT提高8.4℃,对上述突变体进行组合突变,突变体G38V/Q212F、G38V/S274P的活性未能进一步提高。本研究不仅阐明了关键位点对酶活性和稳定性的贡献,还为治疗性酶的设计与开发提供了新思路。