【目的】探究乌蒙山自然保护区野生猕猴桃(Actinidia chinensis Planch)ITS遗传多样性，继而研究其亲缘关系，选育优质新品种。【方法】采用样线法对乌蒙山自然保护区野生猕猴桃的种类、分布及其生态环境进行调查，并将61份猕猴桃属植物样本进行浅层测序，以Actinidia callosa ITS区(登录号：AF323803.1)为模板对获得的基因组数据进行ITS区组装，以获得每个样本ITS基因序列数据。【结果】在乌蒙山自然保护区内，野生猕猴桃属植物集中分布在海拔1241.80～1976.42 m,主要生长于灌木丛中或山坡林缘。分类鉴定结果显示，61份猕猴桃样本分别隶属于1个属(猴桃属),7个种。其中，昭通猕猴桃为云南特有种。将ITS基因组装后比较分析发现，序列长度在501～650 bp,总GC含量在50.88%～57.72%,变化幅度较大；在5.8S区段相对保守，变异率较小；7个种的遗传距离在0.003 09～0.597 00,总体平均遗传距离为0.302 00;其中狗枣猕猴桃和昭通猕猴桃亲缘关系较近，遗传距离为0.003 09,中华猕猴桃与京梨猕猴桃、显脉猕猴桃、葡萄叶猕猴桃和葛枣猕猴桃的遗传距离较近，介于0.042 10～0.071 90,而与昭通猕猴桃和狗枣猕猴桃的遗传距离分别为0.588 00和0.587 00。系统发育分析结果表明，野生猕猴桃的系统发育较复杂，存在地理位置相对较远而亲缘关系较近的情况，说明地理位置的远近可为遗传变异提供变异积累。【结论】乌蒙山自然保护区内猕猴桃科植物多样性丰富，不同种间ITS序列遗传变异位点显著，可为野生猕猴桃种质资源开发利用提供理论基础。