马铃薯缺乏高效的分子育种工具,包括基因编辑、基因表达、分子检测和遗传转化系统等,制约其分子育种和精准育种进程。针对马铃薯生物育种技术瓶颈问题,自主开发生物育种工具箱v2.0,为马铃薯品种改良提供重要技术支持。生物育种工具箱v2.0包含快速克隆及表达载体库和遗传转化及分子试剂盒。(1)快速克隆及表达载体库:含有138套载体,支持亚克隆、原核表达、瞬时表达、酵母表达、过量表达、荧光标记、基因干扰、诱导表达、基因编辑以及辅助表达等多种功能应用。(2)遗传转化及分子试剂盒:含有31种试剂盒,包括植物组织培养基与遗传转化试剂盒、植物原生质体制备及转化试剂盒、细胞高通量核酸极速提取试剂盒、马铃薯种薯质量检测试剂盒等。生物育种工具箱v2.0具有多种优势。(1)多种类多功能表达载体,适用于各种细胞系统,实现了高效、灵活的基因操作;(2)操作简便,适用性广,显著提高实验效率;(3)自主研发,设计中融入了最新的生物育种技术需求,创新性强;(4)模块化设计,适应不同试验条件和生物系统,为基因功能研究和分子育种提供多样化的选择,提升研究的精度和效率;(5)应用价值广,工具箱设计紧贴育种实践需求,为作物改良和现代农业发展提供了关键技术支持,具有较高的推广应用潜力。大部分栽培马铃薯是同源四倍体,基因组高度杂合,遗传背景复杂,导致其遗传转化效率低下,限制了分子育种的高效实施。为提高马铃薯遗传转化效率,研究优化了栽培种"E3"马铃薯的遗传转化体系并以其为材料,对生物育种工具箱v2.0中不同表达载体效率进行大规模测试,发现遗传转化效率与载体种类密切相关,主要由载体骨架中元件的种类、组合及顺序所决定,由此提出"体系适配型载体骨架筛选"及"基因表达盒多元化定制"策略,并基于生物育种工具箱v2.0建立超高效马铃薯转基因技术体系,快速创制出了多种转基因种质资源。(1)体系适配型载体骨架筛选:首先基于生物育种工具箱v2.0,构建目标马铃薯品种的遗传转化体系,进一步筛选出与该体系适配性强的载体骨架,以提高外源基因导入的效率。这一策略强调载体与马铃薯转化体系的匹配性,通过优化载体骨架结构,使之更适合特定马铃薯品种的基因导入和表达,从而克服其遗传转化效率低的瓶颈。(2)基因表达盒多元化定制:确定体系适配型载体骨架之后,充分利用生物育种工具箱v2.0中包含的各类表达元件,针对马铃薯基因组的高度杂合性和表达需求,对基因表达盒进行多样化定制。既能通过个性化定制基因表达盒,满足不同试验目的和研究需求,实现更加精准的基因表达控制和功能验证;也能根据不同目的基因的表达特性,设计合适的启动子、增强子和终止子组合,以实现特定条件下的高效、稳定表达。该试验突破了传统方法的局限性,创新性提出"体系适配型载体骨架筛选"及"基因表达盒多元化定制"策略,并利用该策略将马铃薯遗传转化效率提升至90%以上(以"E3"为例),缩短转基因育种周期,实现基因表达强度在0.001～1 000倍的精准设计,有助于实现更精准、更快速的遗传改良。